#大肠杆菌#

注：本文不构成任何投资意见和建议，以官方/公司公告为准；本文仅作医疗健康相关药物介绍，非治疗方案推荐（若涉及），不代表耀海生物立场。任何文章转载需得到授权。

导读：本文介绍了基因重组后生产用工程菌菌种保存方案，均为国内外菌种库的先进菌种保存方案，这些方案涉及小样库管理、菌株库构建及技术转移的环境控制。本文的方案特别针对环境敏感菌种和增殖低下菌种的特殊方案设计。

一、什么是菌种保存？

菌种的保存主要是指通过降低细菌新陈代谢的速度,使细菌的生命活动处于半永久性休眠状态,以达到长期保藏的目的以及减少菌种的更新需求来降低实验生产成本。

微生物菌种的保存方法由于微生物种类的不同而略有差距，但是通常使用的仍然是以甘油保存、琼脂斜面低温保存、液体石蜡保存法和低温干燥方法为主。

其中大肠杆菌主要使用的是甘油保存和低温真空保存法，而琼脂低温斜面保存主要适用的是细菌、酵母菌、霉菌保藏，液体石蜡保存法适用于保藏部分霉菌，酵母菌和放线菌，对细菌保藏效果较差。

其中甘油保存因其操作较为简单，对于设备需求低而普遍使用。而为低温真空干燥法由于其技术设备条件要求高,一般实验室难以达到故而使用较为受限。

二、基因重组后生产用工程菌菌种保存方案有哪些？

甘油保存

甘油保存主要的原理是在-70℃或液氮中冻存,细菌内的酶活性均己停止,即代谢处于完全停止状态,故可以长期保存。

在0℃—-70℃温度范围内,水晶呈针状,极易招致细菌的严重损伤。用电镜观察,可见细菌的核膜上有大量针尖样小孔。因此,为了避免0℃—-70℃冰晶的形成和细菌膜两侧离子平衡的破坏,需要加保护剂。

甘油可降低冰点,在缓慢的冻结条件下,能使细菌内水分在冻结前透出细菌外。贮存在-70℃以下低温中能减少冰晶形成,甘油对细菌无毒性,分子量小,溶解度大,易穿透细菌。进而提高菌种的存活率。

菌菌珍藏特制甘油保存的装置，并且智能化且可以自适应调整数据，提高保存率。如有需要，请私信。

具体操作：取需要保存菌种的菌液与80%灭菌之后的甘油按照菌液：甘油=5：2的比例混合，零下80度保存(零下20度保存时间较短)。

复苏菌种时，用接种环或牙签挑取少许冻结的菌种到平皿上，37℃培养8-12小时即可。甘油菌从冰箱取出使用时应置于低温或0℃冰浴中，用完尽快放回，接种时挑取表面已融化部分即可，不可全溶，因反复冻融会导致细胞壁破裂。生产用甘油菌一般1年就要重新筛选活化后再使用。

甘油保存主要适用于小样库管理、菌株库构建及技术转移中的菌种保存。在甘油保存中主要由于甘油超低温环境下结晶程度较低，与水相比较形成的冰晶较少对菌体的损伤较小，有利于保障菌种存活率以及复苏后的菌种活性。

筛选活化小指南：甘油菌一般每隔1年要重新筛选活化。很多经验不足的小白会发生失误，导致菌种的活性降低，影响后续产物的表达。菌菌收集了经验大牛的筛选活化指南和其自制的菌种筛选工具，可以起到高效低成本的效果，如有需要可以联系。

低温真空干燥法

菌种保存最为理想的方法就是低温真空干燥法。其主要原理是运用干燥、低温和隔绝空气的手段,降低细菌新陈代谢的速度,使细菌的生命活动处于半永久性休眠状态,以达到长期保藏的目的。但是对于技术设备的要求较高故而使用较为受限。

具体操作：先将所需保存的菌种按常规接种于普通培养基上,经37℃24小时培养后,生长出典型菌落。取出后,塑料袋密封,先放4℃4小时,后移置于-20℃2小时,再置-80℃超低温冰箱中。

低温真空干燥法主要适用于需要长期保存在菌种库的大肠杆菌的保存，通常作为菌种建库的原始菌种，留作申报的储存菌种以及工作菌种的保存方法。

琼脂斜面低温保存法

琼脂斜面低温保存法将经常使用的菌种的典型菌落接种在斜面（某些特殊菌种可用液体培养基）上，每隔2~3个月移种一次，继续进行保藏。

将菌种接种在斜面培养基上，按规定的温度和时间培养，待充分生长后，把培养好的新鲜菌种用牛皮纸保好（为减缓培养基的水分蒸发，延长保藏时间，可将菌种保藏管的棉花塞换成橡胶），放在4℃左右的冰箱中保藏。

斜面保存法主要适用于时间较短的菌种保存，如小样产品的保存和日常工作菌种的使用中保存。

液体石蜡保存法

用石蜡将培养物与空气隔绝，以降低菌种的生理生化水平，并可防止水分蒸发，从而延长菌种的保藏期。

将菌种接种于斜面或穿刺于0.3~0.5%琼脂半固体高层培养基中，培养好备用。取化学提纯的液体石蜡装在试管中，每管10~15mL，加棉塞，瓶口包上纸，℃高压灭菌30min，取出置37℃温箱或~℃烤箱中1~2h或干燥器内除去液体石蜡中的水分。

将上述液体石蜡加入培养好的菌种试管内，液体石蜡液面以高出培养基最上端1㎝为宜，将试管直立，放入4℃冰箱中保藏。

液体石蜡保存法通常作为研发阶段工程菌菌种小样的保存方式，以便于菌种的随时取用。同时以上方法对于对于保存环境以及设备的要求较低，便于操作和实现。

除以上通用方法外，部分菌种由于其特殊的理化性质和生理特性必须采用特殊的保存方法。对此菌菌深有研究，略有心得。如有需求，请私信获取总结经验分享。

三、环境敏感菌种保存有哪些注意事项？

需氧保存的菌种可适用液体石蜡保存法，该方法主要利用限制氧气的供应而使菌种的代谢减缓以达到保存的目的。

产孢能力低下的丝状菌由于其不能耐受超低温，故不能适用低温真空干燥法。

TIP：

1.无论采用何种保藏方法，首先应该挑选典型菌种的优良纯种来进行保藏，对菌株的传代稳定性、目的产物表达量等指标进行评估，菌菌在菌种建库、菌株筛选、菌株传代稳定性检测方面具备丰富的经验。最好保藏它们的休眠体，如分生孢子、芽孢等。其次，应根据微生物生理、生化特点，人为地创造环境条件，使微生物长期处于代谢不活泼、生长繁殖受抑制的休眠状态。这些人工造成的环境主要是干燥、低温和缺氧，另外，避光、缺乏营养、添加保护剂或酸度中和剂也能有效提高保藏效果。

2.为保证保存后复苏菌种的活力通常选择在对数生长期，此时菌种生长最为活跃。作为菌种保存的时期可以保证菌种复苏后的活力。

四、菌种保存保护剂选择

体积分数20%-50%甘油是最常见的菌种冻存保护剂，甘油能够降低细胞冰点，减少冰晶的形成，减轻自由基对细胞损害，改变生物膜对电解质、药物、毒物和代谢产物的通透性。将生长对数期菌种培养物制成悬浊液于冻存管中，加入一定体积的无菌甘油，使甘油的最终体积分数为10%-20%，密封保存在-20℃或-80℃冰箱中。原始菌种为第“0”代，长期保藏在液氮中。

选择合适菌种保护剂能够影响菌种能否成功保存，甘油作为优秀的保护剂已经广为运用。除此之外，随着实验设备的更新真空环境作为保护剂的使用也越来越广泛，其对于菌种保存效果也比甘油保存好。

五、菌种保存培养基的选择

细菌类工业菌种一般采用LB或MRS肉汤培养基进行种子扩培和制备

LB培养基配方

胰化蛋白胨（Trypton）：10g/L；酵母提取物（YeastExtract）：5g/L；NaCl：10g/L；pH7.4

液体培养基：

胰化蛋白胨10.0g

酵母粉5.0g

氯化钠10.0g

水ml

pH7.4

固体培养基：

在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂粉

MRS肉汤培养基配方：（g/L）

蛋白胨10.0g

肉膏10.0g

酵母浸粉5.0g

葡萄糖20.0g

磷酸氢二钾2.0g

柠檬酸氢二铵2.0g

乙酸钠5.0g

硫酸镁0.58g

硫酸锰0.25g

半胱氨酸0.5g

pH值6.2-6.4

酵母菌一般采用YPD培养基进行种子扩培和制备

YPD或YEPD，：YeastExtractPeptoneDextroseMedium(1L)，又叫酵母浸出粉胨葡萄糖培养基，加入琼脂的又叫酵母膏胨葡萄糖（YPD）琼脂培养基

用于酵母菌的培养

配方：

1%YeastExtract（酵母膏），

2%Peptone（蛋白胨），

2%Dextrose(glucose)（葡萄糖），

若制固体培养基，加入2%琼脂粉

丝状放线菌和真菌一般在PDA培养基

PDA培养基是人们对马铃薯葡萄糖琼脂培养基的简称，即PotatoDextroseAgar（Medium），依次对应马铃薯、葡萄糖、琼脂的英文。

配方

马铃薯g

葡萄糖20g

琼脂15~20g

蒸馏水ml

自然PH

六、菌种保存的评价

菌种保存完成后需配置专门人员对菌种的活性、存活率和生产水平进行检测和评估，防止出现菌种的退化和污染。

如出现菌种退化以及污染应及时寻找和调整保存条件，并从原始的菌种中及时寻找并重新制备菌种保存。

菌种保存的评价是菌种保存中至关重要的部分，关系着菌种的保存是否成功甚至于当出现菌种污染以及退化时是否能够快速的重启，直接影响项目推进的成功与否。